Remdesivir的相关总结

一、RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)是Remdesivir抗病毒作用的靶点

1. Remdesivir及其活性成分、结合位点

Remdesivir(GS-5734)是氰基取代的腺苷核苷酸类似物前药,显示出对几种RNA病毒的广谱抗病毒活性。

在Remdesivir抑制埃博拉病毒活性的实验当中,发现Remdesivir是前药,其活性分子为三磷酸化后的(Remdesivir-TP)形式。

图1 左侧为Remdesivir(前药),右侧为Remdesivir-TP(活性成分)

化合物Remdesivir-TP模拟到EBOV聚合酶活性位点。残基Y636突出显示在绿色表面,位于核糖下方,并且对应于RSV中的F704。残基E709突出显示在红色表面,位于核糖的2'-β-H位置附近,对应于 S282在HCV。

图2 Remdesivir-TP模拟到EBOV聚合酶活性位点

2. Remdesivir-TP能够与三磷酸腺苷(ATP)竞争性抑制RdRp活性

有文献报道Remdesivir-TP能够与三磷酸腺苷(ATP)竞争。


酶动力学表明,埃博拉病毒(EBOV)RdRp和呼吸道合胞病毒(RSV)RdRp结合ATP和Remdesivir-TP具有相似的效率。相反的是,在人线粒体RNA聚合酶上,ATP与Remdesivir-TP提升选择性相差为500倍。可以初步证明,Remdesivir-TP与ATP在病毒RdRp竞争性结合。

图3 从上至下依次EBOV-RdRp、RSV-RdRp、人线粒体RNAp小分子结合动力学数据

3. Remdesivir-TP抑制病毒复制机制

利用埃博拉病毒(EBOV) RdRp复合物研究Remdesivir的作用机制。 实验证明,核苷酸类似物在位置i的掺入,导致延迟链终止,其主要在位置i+5。

在所有四个天然核苷酸存在下的对照反应产生预期的14-mer全长产物,在没有ATP和Remdesivir-TP存在的情况下,RNA合成在i+5位置终止,这对应于截短的11-mer产物。这一结果表明,延迟链终止是一种潜在的作用机制。

为了评估延迟链终止是否需要连续的抑制位点,实验者设计了分别在i+1、i+4位置突变的模板。在每种情况下,实验者均观察到RNA合成在i+5位置的终止。

二、Remdesivir体外实验显示可抑制SARS-CoV和MERS-CoV复制

冠状病毒(CoV)家族由1(α)、2(β)、3(γ)和4(δ)组成,可感染鸟类和各种哺乳动物。目前,尚未批准人体抗冠状病毒治疗药物分子。尝试利用经批准的抗病毒药物(即利巴韦林和洛匹那韦-利托那韦)或免疫调节剂(即皮质类固醇、干扰素等)治疗SARS-CoV和MERS CoV患者和在随机对照试验中无效。

常用的抗CoV治疗小分子药物的酶靶点包括组织冠状病毒3C类蛋白酶、木瓜蛋白酶、 非结构蛋白12(nsp12)、RNA依赖RNA 聚合酶(RdRp)等。

在2016年Warren课题组报道了Remdesivir体内抗非人类灵长类动物埃博拉病毒实验。Ralph S. Baric课题组2017年报道了对Remdesivir抑制冠状病毒实验结果。

1、Remdesivir在人呼吸道上皮细胞模型可以抑制SARS-CoV和MERS-CoV

利用人肺Calu-3 2B4细胞(2B4细胞)作为模型,Remdesivir-TP对MERS-CoV的半数抑制率IC50值为0.025μM,CC50值为10 mM。其CC50与IC50比值>400。


图4 2B4细胞模型Remdesivir-TP对MERS-CoV的IC50值测定

2、Remdesivir在人原代呼吸道上皮细胞模型(HAE)可以抑制SARS-CoV和MERS-CoV

人原代呼吸道上皮细胞模型(HAE)是最具生物学意义的体外肺模型。HAE细胞在Remdesivir存在的情况下,在感染复数MOI为0.5时,感染MERS-CoV(红色荧光蛋白,RFP),持续48小时,收集用于病毒滴度测定。结果表明,Remdesivir可以在HAE模型上抑制冠状病毒感染,并有显著的剂量依赖关系。

图5 HAE细胞模型Remdesivir对MERS-CoV、SARS-CoV的抑制

3. Remdesivir在HAE模型上能有效抑制多种人畜共患冠状病毒

冠状病毒RdRp中非结构蛋白nsp12在各物质的CoVs间高度保守,可以作为潜在的药物靶点。实验证实,Remdesivir在HAE模型上有对人冠状病毒CoV、人-蝙蝠冠状病毒CoV和人畜共患前冠状病毒CoV的抑制效果。

4. Remdesivir预防性治疗减少SARS冠状病毒病发生

Remdesivir在小鼠体内的血浆稳定性相对较差,半衰期<5min。由于分泌的羧酸酯酶1c(Ces1c)的表达在人体内不表达,Remdesivir人体血浆稳定性明显提高半衰期约为25min。利用野生型(WT)C57BL/6J的Ces1c–/-小鼠感染冠状病毒进行实验,评价指标为体重减轻和肺部病毒滴度值。研究者尝试每天皮下注射50 mg/kg一次或25 mg/kg,每日两次。

SARS-CoV病小鼠模型再现了许多人类 SARS-CoV发病机制,包括厌食症、 病毒在肺内复制的高滴度,以及急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和与年龄有关的疾病。预防性给药 50mg/kg 每人一次或25mg/kg每日二次可改善SARS-CoV诱导体重减轻。肺部病毒滴度感染后2天和5天明显减少(P<0.05),有统计学差异。

图6 Remdesivir预防性治疗减少SARS冠状病毒病发生

5.暴露后治疗性给药 Remdesivir减轻SARS冠状病毒疾病发生

除预防性给药外,病毒暴露后治疗性Remdesivir大幅度降低 SARS引起的感染者体重减轻,降低了肺部病毒滴度,从而证明给药有效,治疗效果显著(P=0.003) 实验动物肺功能改善。

三、临床实验研究

实验编号NCT02818582及NCT03719586

Remdesivir给药剂量

在第1天静脉注射负荷剂量(成人和儿童体重大于等于40 kg的患者200 mg,儿童体重小于40 kg的患者一次负荷剂量5 mg/kg),然后从第2天开始,持续9至13天,每日一次维持剂量,持续至第10至14天(成人和儿童100 mg体重>=40kg的儿童患者和体重<40kg的儿童患者,Remdesivir 2.5mg/kg)

以上实验均为爆发埃博拉疫情后在刚果的实验结果,具体结果略。






四、耐药及突变

Remdesivir因为可以在体内三磷酸化,作为病毒RdRp的底物掺入到到病毒新合成的RNA链中,进而终止病毒基因组的合成。但在使用过程中,病毒会发生突变进而产生耐药性呢。目前有研究鉴定出来了易发生突变的位点。在病毒RdRp编码的NSP12基因上,出现F476L和V553L,就会降低对Remdesivir的敏感性,但这种突变的病毒本身复制效率也较低。

图6 Remdesivir与NSP12结合易突变位点

五、非人灵长类动物实验

对非人类灵长类动物静脉注射使用Remdesivir,在埃博拉病毒的恒河猴模型中,每日一次静脉注射10mg/kgRemdesivir12天导致对EBOV复制的抑制,保护EBOV感染动物免受致命疾病的影响, 改善临床疾病体征和病理生理标志物。广谱抗病毒药物Remdesivir在体外对其他致病性RNA病毒的活性,包括丝状病毒、其他冠状病毒亦有医疗用途的潜力

图7 Remdesivir非人灵长类动物实验数据

参考文献

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Mulangu S, Dodd LE, Davey RT Jr, A Randomized, Controlled Trial of Ebola Virus Disease Therapeutics. N Engl J Med. 2019 Dec 12;381(24):2293-2303. doi: 10.1056/NEJMoa1910993. Epub 2019 Nov 27.

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发布于 02-06