IVD的原料、工艺和思路

IVD的原料、工艺和思路

在体外诊断试剂产品性能评估,原料占70%,工艺占20%,思路占10%。

按《体外诊断试剂分析性能评估指导原则》,主要的分析性能评估项目有:检测限、线性范围、可报告范围、准确度(回收实验)、准确度(方法学比对)、精密度、干扰实验、稳定性、参考值。目前国际上通常是以美国临床实验室标准化组织(CLSI)的相关标准为依据。

产品性能评估是产品研发、制定产品标准等过程的重要技术支持研究过程,并可能对产品质量造成一定影响。在整个研发过程中,涉及原料、工艺和思路,因为行业处于黄金发展阶段,很少去关注和优化整个研发流程,如果没理顺这三者关系,整个研发流程会陷入盲目与不可持续。

刚接触研发时,一般是以现有体系,包含稳定的配方体系(包被缓冲液、封闭缓冲液、酶标缓冲液、校准品稀释液、发光底物液)和工艺流程,一切就着拿来主义,用已有的配方,就着已有的工艺,按着流程操作,多数工作用于筛选配对,分析数据。

这个入门阶段,一般至少维持2-3年,因为配方体系和工艺体系(以下简称工艺,包含配方和体系)是前人通过大量研究成果而建立的,一般比较稳定,较少修改(就算要改进,权限也是在研发总监手中),加上整个研发思路已经流程化,不用思考太多。很多新技术员,通过这种配对筛选后,会从一定数量的配对中筛选出比较合适的配对,进行下一环节研发,很容易就得出,一个试剂盒好坏,基本取决于原料质量,如果没有筛选到好原料,或者碰到难项目,就无从入手。

我们将原料、工艺和思路,细细拆解来分析,目的是理清性能评估项目中,哪些项目是原料决定的,哪些项目是工艺决定的,哪些项目是两者共同影响的,促进研发思路的形成与成熟,希望能够抛砖引玉。

一.原料

我们将免疫试剂中关键原料提炼出来,分为两块:抗原抗体和特殊成分。

1、抗原抗体 免疫试剂一般可以分为两个过程:免疫反应和显色反应。免疫反应是核心,将待测物特异性地从复杂样本中分离出来,这一环节的好坏,直接决定整个试剂的核心质量。

在工业生产上,免疫检测用的抗体,一般是通过工程菌表达抗原片段,免疫动物,进行多克隆或者单克隆抗体制备,然后得到的抗体,进行配对筛选,选出合适的配对应用于免疫检测。在这个过程中,由于待测抗原一般都是天然抗原(少数科研检测重组抗原),而制备和筛选抗体一般又是使用重组抗原,因此会带来很多应用问题,这个对抗体制备商来说,值得重视。

2、特殊成分 免疫反应做为一个脆弱的非共价键结合过程,整个反应受时间、干扰物、桥联物、结构类似物等影响,为消除这些不良影响,一般在缓冲体系中会增加一些特殊成分,这些特殊成分我们定义为次要原料,在工艺中详述。

二.工艺

工艺包含配方体系和工艺流程,两者相辅相成。所有的配方和工艺,是为保障和提高产品性能而设计的,当原料无法满足产品性能要求时,如何通过配方工艺来提高,或者说,哪些性能能通过配方工艺来提高,如何来提高,哪些只能由原料决定,这个在我们研发职业生涯中,要不断积累与完善。

1、配方体系 配方体系可以拆解为缓冲体系和改进体系。

(1)缓冲体系 一般的缓冲体系,在教科书、产品说明书、论文中均可见到,主要包含离子对类型、离子浓度、pH值等内容,非保密配方,比较容易理解与掌握。

(2)改进体系 因为免疫反应的非共价键结合的脆弱性,依靠一个简单缓冲体系,要获得很好的反应结果,是比较困难的,针对这种问题,科学家设计了各种改进体系,这些体系下面,又有各种方法产生。

A、降低本底体系

a、使用合适的包被、标记浓度,一般采用棋盘滴定确定。

b、加入增加溶解率,降低非特异吸附的物质,如曲通、吐温。

B、减少干扰体系

a、加入正常鼠血清或者鼠IgG,降低人抗鼠抗体影响

b、加入阻断剂,降低类风湿因子干扰

C、减少前带效应体系

a、适当提高包被和标记浓度,兼顾本底

b、加入检测抗体裸抗,兼顾灵敏度

D、增加灵敏度体系

a、加入曲通、吐温等

b、加入特殊物质,如S19

E、提高检出率体系

a、多个抗体联合使用,如CnTI项目

F、提高稳定性体系

a、缓冲液加入保护性蛋白、糖类、小分子化合物

G、等等其他体系 随着研究深入,这个目录会不断增加,相应的方法也会不断增多。

2、工艺流程 工艺流程,又包含生产工艺流程和试剂盒检测操作工艺流程两个方面。

(1)生产工艺流程 生产工艺流程,对整个的产品性能,有非常大的影响,比如预包被板制备工艺,包被、封闭、干燥的温度、时间,对整个性能影响很大,需要研发摸索。

(2)检测操作工艺流程 相比生产工艺,试剂盒的检测操作工艺,对性能影响更大,一步法、两步法,加样量,加样顺序,温育温度,温育时间。

三.思路

我们分析原料与工艺,就是为了找到一个合适的研发思路,指导研发过程,提高研发效率,整个研发思路,我们再划分为产品研发和改进研发两个问题。

1、产品研发 产品研发是一个从无到有的过程,多数是根据市面上已有的试剂,研发自己公司没有的产品。这个过程占研发的大头,我们再将其细分为初步研发、预临床实验和稳定性测试三个过程。所有的研发,我们都必须知道,一个性能项目,他是怎么评估的,哪些因素会影响这个性能,如何改进,我们以双抗体夹心为例列举。

(1)初步研发 初步研发时,一般重点强调三个活性成分:包被抗体、检测抗体、校准品。包被抗体和检测抗体,会有一个经验浓度,校准品一般用合适基质,将抗原或者高值样本进行梯度稀释,获取的梯度浓度进行第三方赋值,追溯到国际、国家或者企业标准品。

初步研发多数是在做配对筛选,只需要用检测限、线性范围、可报告范围这三个性能评估项目,即可筛选出候选配对。比如拿到10株抗体,可以做成100个配对,进行筛选,选出初步可用的候选配对若干对。

对初筛的候选配对,进行精密度、准确度(回收实验)、干扰实验评估,通过这些实验,再二次筛选候选配对。

(2)预临床实验 不涉及临床血清样本的初步研发都完成后,获得一定的候选配对,进行预临床实验,主要是评估准确度(方法学比较)和参考值区间。

(3)稳定性测试 通过上面两个步骤,试剂盒初步成型,活性组分(包含预包被板、校准品、酶标抗体)的稳定性,需要一一评价与改进,直到满足要求。

2、改进研发 整个试剂盒的研发,最终就是为了检测临床血清样本,所有的分析性能评估项目,也是为这个目的而设计,但是在整个研发过程中,不管是预临床试验,还是正式临床试验,配对测试的临床血清样本量,是非常有限的,顶多就算是完成一个小试生产。到真正产品上市和临床应用时,随着样本量的扩大,很多之前没有暴露的问题,都会集中暴露,必须收集足够数据,进行改进研发。

一般这个阶段,就是针对临床不符合的样本,特别是假阳性、假阴性样本,要对样本进行不同厂家试剂检测比对,成分分析等等,这个过程在预临床和正式临床都会做,在预临床和正式临床时,还要对检测值严重不符,但并未导致假阳、假阴性的样本,进行分析。

发布于 2017-10-19