ImageJ实用技巧——平均荧光强度检测(定量分析篇)

ImageJ实用技巧——平均荧光强度检测(定量分析篇)

免疫荧光染色是研究特异蛋白抗原在细胞内分布的一种常用实验技术,通过荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下对抗原进行细胞定位。

但免疫荧光的照片不仅仅可以做形态学分析,还能通过检测平均荧光强度对特异性蛋白表达进行半定量分析

下面是一张激光共聚焦显微镜拍的荧光照片,通过这个实例介绍一下,怎么利用ImageJ进行平均荧光强度的检测

1、加开图像后,将图像转为8-bit(Image-Type-8-bit)


2、反转图像(Edit-Invert)(可选)

补充:这一步是可选的,反转是为了演示以及设定阈值时看的更清楚,可以不用反转。

但需要注意,如果反转了但没有进行Calibrate,最后的结果会出现:荧光强的反而Mean值低。这是因为反转相当于做了一次运算:(255-Gray value)。所以最后的结果需要用255减去。


3、进行校准(Analyze-Calibrate)(可选)

Calibrate界面

点击OK后出现校准图,关闭即可

关闭即可

Function:选Uncalibrate OD

勾选Global calibration,则打开新的照片默认Calibration不用重复操作。

不勾选则每次都需要重复进行Calibrate(校准)

这里需要解释一下这一步骤,这一步骤将8位图像的灰度值转换为未校准的光密度值
通过这一公式Uncalibrated OD = log10(255 / ( Gray Value )

所以我们最后得出的值其实是光密度(Optical Density),也就是吸光度。

注意:这一步其实是可选的,Calibrate前后得到的结果趋势是一致的。


4、调整阈值,选择适当的区域(Image-Adjust-Threshold)

红色范围即为选中范围
软件会自动选取一个默认值

统一选取默认值(为了消除不同照片,因为手动选取阈值造成的误差,最好使用默认的阈值)。不用点击Apply、Set等按键,这时其实已经选中了

注意:如果图片上有比例尺,必须调节Threshold去掉比例尺,否则会影响结果。


5、设定需要测量的参数(Analyze-Set Measurements)

确认勾选Mean gray value和Limit to threshold(十分重要),点击OK


6、检测(Analyze-Measure)

弹出检测结果

Mean即为平均荧光强度。(Mean即Mean value,等于IntDen/Area)

IntDen=Integrated Density(光密度总和)

可以将结果复制到Excel或者直接导出生成csv文件(Results窗口-File-Save as)


这样我们就得出了图片的平均荧光强度,但需要注意的是:免疫荧光是半定量分析,平均荧光强度只能半定量地表征特异性蛋白的表达

主要是因为免疫荧光实验中的人为因素太多,例如拍照时的曝光、焦距等等,而且非特异性结合的因素也不能完全消除。所以我们在拍照的时候,以及处理数据的时候,一定要有一个固定的标准和流程,从而减小误差。

编辑于 2019-06-26

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